詳情請看：感受態細胞制備

方法一：

效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。

實驗試劑：

A液：1M，MnCl2

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；

C液 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液（46ml）中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。

實驗步驟：

1、 劃線得到單菌落,37℃培養箱培養約17小時。

2、 挑取2-4個形態飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養基的三角瓶,37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養3-4小時。

3、 將培養溫度調至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養，其余與普通感受態差不多。

4、 每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮。

5、 加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。

6、 用紗布將所有裝有感受態的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。

7、 取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。

注意事項：

1、 潔凈是zui重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。

2、 離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g 5min。

3、 涂板不要覺得不勻而多次反復，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。

4、 涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。

5、 預冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要。

方法二：

本法效率*,建議大家采納。

實驗步驟：

1、 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度過夜至長出單菌落。

2、 挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個, 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養基. 培養基量不可再多,會影響效率。

3、 在18度 150-250RPM 培養19-50小時。沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度。

4、 OD600約0.4-0.8時停止培養, 放在冰水中冷卻10分鐘。

5、 4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體。

6、 去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘。

7、 再次離心回收菌體。

8、 用1/12.5體積的TB懸浮, 添加zui終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘9.0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上。

9、 在液氮或-80度保存。

10、 將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養活化。

11、 挑取經活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養基，18℃，200-250rpm培養。

12、 當OD600=0.5-0.8時，用預冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。

13、 用預冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。

14、 重復第4步操作。

15、 用8mL預冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。

16、 冰浴10min后，分裝保存于液氮中。