RT┐PCR分析肉芽組織生長(zhǎng)過(guò)程中VEGF及β3整合素
血管生成指在已有血管床基礎(chǔ)上長(zhǎng)出新的毛細(xì)血管的過(guò)程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、移行，管腔結(jié)構(gòu)形成及血管外膜的形成，然而迄今為止確切的機(jī)制尚不清楚.已有研究表明，許多病理過(guò)程如腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病變、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，都與血管生成密切相關(guān)［1］ .生理狀態(tài)下，血管生成僅存在于胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合及女性生殖周期中，與病理性血管生成不同，這些過(guò)程中血管的生長(zhǎng)受到嚴(yán)格調(diào)控，包括了增殖、成熟、退化三個(gè)階段，反映了血管生成的全過(guò)程.然而，對(duì)這些過(guò)程中血管生成的研究卻很少.生長(zhǎng)因子和粘附分子作為血管生成的重要調(diào)節(jié)分子，越來(lái)越受到人們的重視，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）和β3整合素是近年研究的熱點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)旨在觀察肉芽組織生長(zhǎng)過(guò)程中VEGF及β3整合素mRNA的表達(dá)，揭示它們與生理性血管生成的關(guān)系.
1 材料和方法
1.1 材料 肉芽組織標(biāo)本均取自我院門(mén)診換藥室患者，4例為皮膚撕脫傷，1例為狗咬傷，患者年齡20～30歲，排除糖尿病等影響傷口愈合的疾患，分別于傷后7～12d和30～35d取創(chuàng)面組織.正常皮下組織取自我院手術(shù)患者.
1.2 試劑及儀器 異硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分別購(gòu)自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480，美國(guó)PE公司;GDS凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司.
1.3 RT┐PCR
1.3.1 引物設(shè)計(jì) 按文獻(xiàn)報(bào)道［2，3］，VEGF上游引物序列:5'-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3'，下游引物序列:5'-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3'，PCR產(chǎn)物為567bp，495bp和363bp，β3整合素上游引物序列:5'-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3'，下游引物序列:5'-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3'，PCR產(chǎn)物為285bp.
1.3.2 總RNA提取及定量 所取組織用Chom-czynski改良一步法提取總RNA，通過(guò)測(cè)定A260 值計(jì)算RNA濃度，A260 /A280 判定純度.
1.3.3 RT-PCR反應(yīng) 各組織總RNA均取1μg（10μL），加25μmol·L-1 逆轉(zhuǎn)錄引物（下游引物）1μL，70℃10min后立刻冰浴，加入下列成分:DW5μL，5x RT緩沖液5μL，10mmol·L-1 dNTP各1μL，RNasin0.5μL（25U），AMV1μL（5U），42℃逆轉(zhuǎn)錄1h，94℃5min，冰浴5min.各取RT產(chǎn)物10μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同于常規(guī)PCR，循環(huán)溫度為:94℃1min，55℃1min，72℃2min，循環(huán)數(shù)分別采用15，20，25和30，根據(jù)結(jié)果選擇合適循環(huán)數(shù)，避免PCR反應(yīng)平臺(tái)期，zui終確定為25個(gè)循環(huán)，0.2g·L-1 瓊脂糖凝膠觀察結(jié)果.
1.3.4 熒光分析 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在UVP凝膠成像系統(tǒng)上攝像，并用相應(yīng)軟件通過(guò)對(duì)條帶大小及深淺的差別分別對(duì)不同組織RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，結(jié)果采用*隨機(jī)化設(shè)計(jì)資料均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.
2 結(jié)果
VEGF有多種不同的mRNA拼接產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)選用引物可擴(kuò)增出VEGF121 （363bp），VEGF165 （495bp）和VEGF189 （567bp）3種形式.電泳結(jié)果表明，VEGF可見(jiàn)3條擴(kuò)增帶，大小同預(yù)期設(shè)計(jì)一致（Fig1）β3整合素PCR產(chǎn)物為265bp，電泳顯示300bp附近可見(jiàn)明顯擴(kuò)增帶，與預(yù)期一致（Fig2）由電泳結(jié)果可以看出，正常皮下組織中VEGF及β3整合素mR-NA水平極低，在增殖期肉芽組織中表達(dá)明顯升高，在成熟期肉芽組織中表達(dá)又降低，而且，在VEGF的 3種不同拼接產(chǎn)物中，VEGF165 表達(dá)zui高.
圖像分析定量的結(jié)果表明，在增殖期肉芽組織中，VEGF及β3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽組織（P<0.05）及正常皮下組織（P<0.01，Tab1）.
圖1 － 圖2 略
3 討論
VEGF是近年發(fā)現(xiàn)的可以特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的生長(zhǎng)因子.體外實(shí)驗(yàn)證明VEGF可以直接促進(jìn)EC的增殖，還可以通過(guò)提高已有血管的通透性，使血漿蛋白滲入基質(zhì)，利于EC的移行，間接促進(jìn)血管生成［4］ .β3整合素屬粘附分子家族成員，可與αIIb或αV亞基結(jié)合，其中αVβ3分子在血管生成中的作用備受關(guān)注，表達(dá)于細(xì)胞膜表面，識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)的RGD序列，對(duì)于EC的移行有重要意義［5］ .本實(shí)驗(yàn)表明，正常皮下組織中沒(méi)有血管生成的存在，VEGF及β3整合素mRNA的表達(dá)很低;在肉芽組織增殖期，HE切片證明EC在局部聚集成團(tuán)，胞質(zhì)增多，增殖明顯，增殖的EC借助與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合移行形成大量新生血管芽，此時(shí)VEGF及β3整合素水平明顯增高，待肉芽組織*成熟后，新生血管逐漸成熟退化，二者的表達(dá)也隨之下降，表明VEGF及β3整合素可能是血管生成重要的始動(dòng)分子，對(duì)于維持血管生成也有重要作用;同時(shí)也提示它們可以作為臨床血管生成治療的“靶分子”.VEGF及β3整合素受控表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，缺氧及某些炎癥因子可能參與其中的調(diào)節(jié)［6，7］ .
表1 不同組織中VEGF及β3整合素mRNA表達(dá)水平的定量分析結(jié)果 略
RT-PCR適于用Northern blot檢測(cè)不到的低豐度RNA.實(shí)驗(yàn)證明，同一循環(huán)體系下，模板量在一定濃度范圍內(nèi)時(shí)，PCR產(chǎn)物條帶強(qiáng)度與模板量成比例關(guān)系;當(dāng)循環(huán)次數(shù)處于PCR擴(kuò)增的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度同模板量亦成比例關(guān)系［8］ ，因此用RT-PCR定量分析mRNA的關(guān)鍵是嚴(yán)格優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如模板量及循環(huán)次數(shù)的控制等，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)幾次結(jié)果一致.
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