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武漢艾美捷科技有限公司
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閱讀：410發布時間：2020-7-1
免疫沉淀 (Immunoprecipitation，IP) 是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與ProteinA/G偶聯的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復合物，沉淀經過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
在免疫沉淀實驗后的WB驗證環節中，當使用常規的 Anti-IgG (H+L) 酶標二抗時，通常會出現對應免疫沉淀一抗變性后產生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時，就會受到這兩條帶的干擾。
如何避免IP檢測過程中的重、輕鏈干擾？
一般解決辦法：選擇不同種屬來源的一抗分別進行IP和WB實驗，然后再選擇無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗；這種方案相對來說比較昂貴，需要買兩個一抗和兩個對應的二抗。
Abbkine解決方案：產生此問題的重點在于實驗中目的蛋白的信號模糊，無法進行判斷，那就需要在根本上將干擾的信號降到低，而IPKine系列二抗經過特別設計和優化，可以和重/輕鏈特異性結合從而明顯看到目的蛋白信號。如果目的條帶在55kDa左右，可以通過選擇與輕鏈特異性結合的二抗，來消除重鏈條帶對目的蛋白檢測的干擾。如下圖：
IPKine是一系列新型的二抗產品，能有效解決IP-WB后的輕/重鏈干擾問題。IPKine系列二抗經過特別優化，不會與IgG的輕/重鏈分子結合，只識別IgG分子的重/輕鏈部分，從而能有效解決IP實驗后的WB檢測中面臨的輕/重鏈干擾信號降到低。
另外，IPKine系列二抗經過特別優化，其針對目的種屬的特異性非常高，同時針對其他非目的種屬的抗體分子的非特異性結合降到低，從而有效避免了二抗與樣本內免疫球蛋白分子的非特異性雜交，提高實驗的特異性和信噪比。
IP實驗常見問題匯總：
結果 | 原因 | 解析 |
顯影信號整體很弱，熒光信號淬滅 | 顯影液失效 | 通過檢查顯影液清澈度初判，并通過立即更換新顯影液后再曝 |
底物失效 | 將PVDF膜重新TBST略洗幾次，重新加合格的底物 | |
二抗孵育過多 | 如果操作較快，會出現第1張膠片曝光后信號*，而第2張起可能信號淬滅；如果操作稍慢點，甚至第1張膠片起信號基本淬滅，這種情況建議重做，降低二抗濃度、減少孵育時間 | |
條帶正確，但顯影過強或過弱 | 上樣量過大 | 可減小上樣量、提高一抗稀釋度并縮短曝光時間 |
上樣量過小 | 可增加上樣量、降低一抗稀釋度并延長曝光時間 | |
背景雜亂厚重，大片“黑區”，導致無法分析 | 一抗孵育時間過長 | 4℃封閉過夜，一抗孵育1 hr，并可適當增加洗膜時間 |
Input泳道無目的帶，而IP泳道有 | 目的蛋白豐度不高，無法直接 Western blot 檢出，而 IP 能進行濃縮富集 | |
Input泳道有目的帶，而IP泳道無 | 該種一抗主要識別和結合靶蛋白內部的線性表位、而非暴露在外表的的線性或空間表位，故IP制樣時無法有效捕獲住組織或細胞中的完整結構靶蛋白 | |
該蛋白濃度極低，導致捕獲過程不僅未起到富集作用，反而因為洗滌操作，使靶蛋白損失殆盡，后幾乎無靶蛋白被洗脫下來；或lysis buffer過強；或選用了不正確的beads； 或一抗亞型為 IgM 或 IgA | ||
Abbkine專注于蛋白學和細胞學領域，致力于創新和研發各類抗體、蛋白質、分析試劑與試劑盒，以期成為生命科學研究發展、藥物研發等領域的關鍵推動者。我們為您提供蛋白和免疫研究用戶喜愛的產品，從免疫學基礎產品，如蛋白提取定量，到免疫學實驗的內參標簽抗體、一抗及二抗等；細胞研究用戶喜愛的產品，從用于檢測細胞狀態的染料及試劑盒，細胞器提取試劑盒，細胞亞結構染色示蹤及細胞代謝檢測產品，到用于細胞培養的細胞因子及蛋白類檢測試劑盒，只為助力您的研究事業！
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