抗體水平測(cè)定法

1．本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求
掌握雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測(cè)定法，以便檢查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理
    某些病毒（如新城疫病毒，禽流感病毒等）能夠與動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，此即為紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象（HA）。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可于病毒懸液中加入特異免疫血清所抑制，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）。
3．需用的儀器或試劑等
動(dòng)物 健康成雞2-5只，被檢雞15-25只。
器材 高壓滅菌器、濾紙、試管、試管架、離心機(jī)、離心管、三棱針、內(nèi)徑2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精燈、石蠟、96孔V型微量凝集試驗(yàn)板、0.025mm微量吸液器、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。
藥劑（1）濃縮抗原；（2）生理鹽水或磷酸緩沖鹽水（PBS）；（3）Alsever細(xì)胞保存液；（4）紅細(xì)胞懸液；（5）待檢血清
4．實(shí)驗(yàn)步驟
（1）發(fā)現(xiàn)與鑒定病毒：雞新城疫和禽流感病毒分離后，這些病毒能凝集雞的紅細(xì)胞，又能被特異性的已知免疫血清抑制其凝集反應(yīng)，即可鑒定此病毒。
 （2）診斷病毒性疾病：如取同一發(fā)病的動(dòng)物早期和恢復(fù)期血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)，如抗體效價(jià)有4倍以上升高，即有診斷意義。
（3）免疫機(jī)體抗體效價(jià)的測(cè)定：
 3.雞新城疫（ND）的HA和HI
（1）試驗(yàn)準(zhǔn)備  
 ① 抗原：一般以雞新城疫Ⅱ系或LaUra系凍干苗作為已知抗原，進(jìn)行試驗(yàn)。
 ② 0.7％細(xì)胞懸浮液：由雞翅靜脈或心臟采血，放入含有抗凝劑的滅菌試管（按每毫升血加入3.8％滅菌檸檬酸鈉0.2毫升做抗凝劑）內(nèi)，迅速混勻。如當(dāng)時(shí)不用，可直接采血放入紅細(xì)胞保存液內(nèi)（保存液2份，血液1份）于4℃冰箱內(nèi)可保存兩周。
紅細(xì)胞懸液的配制：將血液注入離心管中，經(jīng)3000轉(zhuǎn)／分鐘，離心5-10分鐘，用吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，將沉淀的紅細(xì)胞加稀釋液（生理鹽水）洗滌。再用離心機(jī)3000轉(zhuǎn)／分鐘離心5-10分鐘，棄上清，再加稀釋液洗滌，如此反復(fù)洗滌三次，將zui后一次離心后的紅細(xì)胞泥，按0.7％的稀釋度加入稀釋液（0.7毫升紅細(xì)胞泥加99.3毫升稀釋液）。
 ③ 被檢血清：將被檢雞群編號(hào)登記，用消毒過(guò)的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管內(nèi)（微量法可用孔徑2-3毫米塑料管由翅靜脈采血），在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。每只雞應(yīng)更換一個(gè)注射器，嚴(yán)禁交叉使用。
④ 稀釋液：為滅菌的生理鹽水。
⑤ 紅細(xì)胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉（SHOO）0.80克，檸檬酸（2H20）0.055克，氯化鈉0.42克，蒸餾水加至100毫升。過(guò)濾分裝，高壓滅菌10分鐘，放4℃冰箱保存。
（2）紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）   主要是測(cè)定病毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)，以確定紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所用病毒稀釋倍數(shù)（抗原單位）。
雞新城疫病毒的HA試驗(yàn)與HI試驗(yàn)現(xiàn)采用微量法，以u(píng)或v形微孔塑料板代替試管。
① 首先用移液器向每個(gè)孔加入稀釋液一滴（0.05毫升）。
② 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入*孔，反復(fù)抽動(dòng)6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反復(fù)抽動(dòng)6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此連續(xù)稀釋至第十一孔后吸出0.05毫升棄去。第12孔不加病毒液為紅細(xì)胞空白對(duì)照。

人胎兒胸腺細(xì)胞株HFT-8810  
人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1  
人前列腺正常細(xì)胞RWPE-2  
人男性正常龜頭細(xì)胞Hs68  
人整合 SV40基因的乳腺上皮細(xì)胞HBL-100  
人前列腺癌細(xì)胞DU 145  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231  
人前列腺癌細(xì)胞LNCaP  
人乳腺癌細(xì)胞MCF 7B  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞ZR-75-1  
人乳腺導(dǎo)管瘤細(xì)胞UACC812  
人前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)C-3M-IE8  
人前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)C-3M-2B4  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞HCC38  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞ZR-75-30  
人乳腺癌瘤株MCF7  
人乳腺癌細(xì)胞BT-20  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞BT-549  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞MDA-MB-175Ⅶ  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-415  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞MDA-MB-435  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-436  
人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37  
人前列腺癌細(xì)胞LNCaP clone FGC  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S  
人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3  
人髓狀甲狀腺腫瘤細(xì)胞TT  
人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞T47D  
人乳腺癌細(xì)胞BT-549  
人前列腺癌細(xì)胞22Rv1  

人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞HEL細(xì)胞 （凍存、復(fù)蘇）
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468  
人甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW579  
人乳腺癌細(xì)胞Hs 578T  
人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468-06  
人乳腺導(dǎo)管瘤細(xì)胞BT-474  
人乳腺癌細(xì)胞HCC1937  
人前列腺癌細(xì)胞PC-3  
人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30  
人乳腺癌細(xì)胞MCF7  
人乳腺癌細(xì)胞BC－009  
人乳腺癌細(xì)胞BC－019  
人乳腺癌細(xì)胞BC－020  
人乳腺癌細(xì)胞BC－021  
人乳腺癌細(xì)胞BC－022  

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細(xì)胞介紹：

細(xì)胞名稱(chēng)      小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；3T3-Swiss albino
形態(tài)特性       成纖維細(xì)胞樣
生長(zhǎng)特性      貼壁生長(zhǎng)
特征特性       3T3細(xì)胞株是1962年Todaro G和Green H從分離的瑞士小鼠胚胎中建立的；該細(xì)胞的生長(zhǎng)受接觸性抑制，匯合狀態(tài)的單層細(xì)胞密度為40000個(gè)細(xì)胞/平方厘米；檢測(cè)結(jié)果顯示該細(xì)胞鼠痘病毒陰性；在塑料瓶中生長(zhǎng)較好，在某些玻璃表面上可能狀態(tài)不佳；細(xì)胞生長(zhǎng)飽和時(shí)其密度可以達(dá)到約50000 cells/cm2。
培養(yǎng)條件       DMEM-H: Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DME H-21 4.5g/Liter Glucose）  10%FBS
傳代方法       1:3傳代；3~4天1次。
傳代情況      C5
凍存條件       基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%DMSO+20%FBS
支原體檢測(cè)      培養(yǎng)法（-）