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NK細(xì)胞克隆的制備

ATCC細(xì)胞,傳代細(xì)胞,BD培養(yǎng)基  基本原理

NK細(xì)胞克隆來源于NK細(xì)胞,該細(xì)胞的分離方法.這些NK細(xì)胞與經(jīng)γ射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞苓而獲得的NK細(xì)胞克隆。

試劑和材料
植物血凝素（PHA）母液為100μg/ml重組IL－2（rIL－2）母液為105u/ml，分裝小瓶（0．5ml/瓶),置－20℃長期保存，或置4℃下短期存放。應(yīng)避免反復(fù)凍融，IL－2 不能用濾器過濾除菌處理。
培養(yǎng)基
1.接種培養(yǎng)液:RPMI1640＋10％FCS＋0.5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml 鏈霉素＋1mmol/L丙酮酸鈉。
2.飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液:RPMI1640＋10％FCS＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素＋1mmol/L丙酮酸鈉。
3.NK 克隆培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml鏈霉素＋1mmol/L丙酮酸鈉,經(jīng)0.2u 濾板過濾再加入100u/mlIL－2。
4.培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS。
飼養(yǎng)細(xì)胞：自體或同種異體PBMC
器皿和儀器：96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、多頭移液管、微量移液管、倒置顯微鏡、CO2 孵箱、低溫離心機(jī)、垂直氣流超凈臺(tái)

實(shí)驗(yàn)操作
1.NK細(xì)胞的制備
制備NK.懸浮NK于接種培養(yǎng)液中,細(xì)胞濃度調(diào)至106/ml。
2.接種NK細(xì)胞
制備飼養(yǎng)細(xì)胞(PBMC),于4℃用300×g離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min。被離心的飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于飼養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml。用強(qiáng)度5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞，于4℃用300×g離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，將離心細(xì)胞再懸浮于飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，飼養(yǎng)細(xì)胞濃度調(diào)2×106/ml。
在6 塊96 孔培養(yǎng)板的各孔中加100μl 上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（總量用60ml 飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，含1．2×108 個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞）。將96 孔板置37℃孵箱預(yù)溫，直到加入NK 細(xì)胞。
將NK 細(xì)胞懸浮于接種培養(yǎng)液中，并于預(yù)溫的96 孔板中加入100μlNK 細(xì)胞，使成為10 細(xì)胞/孔、5 細(xì)胞/孔和2．5 細(xì)胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復(fù)二塊板。
將培養(yǎng)板置5％CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)。
3.NK 細(xì)胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞）
從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。每孔中加入含有經(jīng)照射的飼養(yǎng)細(xì)胞（2×106 細(xì)胞/ml）的NK 克隆培養(yǎng)液100μl。此培養(yǎng)液的制備方法如下：
融化飼養(yǎng)細(xì)胞，移至50ml 試管中。輕輕地加入培養(yǎng)液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞。用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，并計(jì)數(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。
按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于NK 克隆培養(yǎng)液中，調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106/ml。
4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆培養(yǎng)液100μl。
5.檢測NK 細(xì)胞的生長狀況（9－10 天）如檢查有細(xì)胞生長，按第8 天的操作換液。
6.分離克隆（11－15 天）
1） 當(dāng)培養(yǎng)液顏色變黃時(shí)，證明細(xì)胞已生長，在96 孔板上將生長的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆培養(yǎng)。
2）在96孔板上擴(kuò)增克隆，并重復(fù)第7天的操作。