*步：準備好配制培養基的一切用具和試劑。

第二步：稱量5 g瓊脂和30 g蔗糖，溶解在大約所要配制培養基 2/3~3/4左右體積（約600~750 ml）的（蒸餾）水中，加熱溶解，不時攪拌，避免出現瓊脂生塊和泡沫。

第三步：根據用量，用量簡或移液管從母液中取出所需量的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物質、激素（每做1000 ml培養基，取20 ml大量成分、20 ml氯化鈣母液、10 ml微量成分、10 ml鐵鹽母液和10 ml有機成分，以及3.0 mg NAA），放入預先有少量蒸餾水的燒杯中（以免加藥液時濺出），然后加入瓊脂和糖水溶液中攪拌混勻。

第四步：加水定容。待攪拌均勻后，用數滴稀堿（NaOH）將pH值調節到預定水平（一般為pH 5.8），當pH值偏堿時用稀酸（HCl）調節。用pH試紙或酸堿指示（或pH）計測定培養基的pH值。

第五步：將培養基用漏斗分裝到培養容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加蓋。

第六步：培養基進行滅菌。高壓蒸氣滅菌鍋的溫度為121℃，滅菌15~20分鐘。

培養基常用高溫高壓（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸氣滅菌的方法，滅菌時間應根據培養瓶體積大小及其內培養基容量多少而定（見表4）。體積和容量越大，所需滅菌時間就越長。空試管、空三角瓶和濾紙要在130℃下滅30分鐘或121℃滅60分鐘。空的培養容器不應同盛裝培養基的培養容器一起高壓蒸氣滅菌，不同體積培養容器或盛裝不同容量的培養基也不能一起高壓蒸氣滅菌，而應該分別進行。因為熱穿透力是一個需要考慮的因素，體積大的培養容器需要較長的時間滅菌，是因為熱量穿透大體積培養基要比體積小的花更多的時間。利用高壓蒸氣滅菌鍋進行滅菌具有簡單、快速，并且可以附帶殺滅病毒又不吸收的優點（與過濾滅茵比較）。其缺點是會引起pH值的變化、發生化學變化和引起某些化合物的分解，使得某些培養基成分的活性喪失。高壓蒸氣滅菌會引起以下物質分解：蔗糖（分解為葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%會喪失反應活性）維生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物提取液（活性喪失）。所以，原生質體培養用培養基應采用過濾法滅菌。

表4 培養基或無菌水的zui少滅菌時間
容器分裝體積（mL） 121℃下zui少滅菌時間（min）
20~60 15
75~150 20
250~500 25
1000以上 30以上

過濾滅菌可以除去溶液或液體培養基中直徑大于過濾膜網孔直徑的微粒、微生物和病毒。與高壓蒸氣滅菌法相比，該法不會改變那些在高壓蒸氣滅菌中不穩定物質，但是也有些明顯的缺點，如復雜而費時。通常采用0.22~0.45μm孔徑的醋酸纖維素或硝酸纖維素膜篩。對培養基中的不穩定成分進行過濾滅菌時，首先對除不穩定成分以外的培養基進行高溫高壓滅菌，滅菌后放置于超凈工作臺中冷卻，溫度降到40~50℃時，在瓊脂培養基尚未固化之前，在無菌條件下用注射器和無菌微孔濾膜（圖1.7）將高溫不穩定物質溶液打入培養基。