三種不同的核酸酶——s1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶Ⅶ被用來進行RNA定量，確定內含子位置，以及用來鑒定在克隆的DNA模板上的mRNA 5′端和3′端的位置。當檢測RNA被雜交到DNA模板上時，用核酸酶S1進行保護試驗的分析;當檢測RNA被雜交到來自DNA模板的RNA上時用RNA酶。外切核酸酶Ⅶ有更專一的用途——對短的內含子作圖并解決S1核酸酶保護試驗中出現的異常情況。

這三種酶的使用方法是Berk和Sharp(1977)提出的經典S1核酸酶保護試驗技術的改良。含有目的mRNA的RNA樣品與互補的DNA或RNA探針在利于形成雜合體的條件下溫育。在反應的末期，一種酶用來降解未雜合的單鏈RNA和DNA。剩下的DNA-RNA或RNA-RNA雜合體用凝膠電泳分離，接著用自顯影或southern雜交來觀察。當探針的摩爾數在雜交反應中過量時，信號的強度和樣品中的目的mRNA的濃度成正比。用過量探針與一系列定量靶序列雜交作出標準曲線，從而準確估算樣品濃度。S1核酸酶保護試驗的zui初模式中一個主要的問題是用雙鏈DNA作為探針。為防止探針DNA在雜交一步重新結合，理想的情況是建立有利于形成RNA-DNA雜合體遠甚于形成DNA-DNA雜合體的反應條件，但并不總是可行。因為DNA-RNA雜合體比DNA-DNA雜合體略微穩定，復性條件一般是含80%甲酰胺、溫度高于雙鏈DNA熔點的計算值。然而，在這種條件下，雜交速度降低約10倍，而且DNA-RNA雜體產物的穩定性也不確定。使用單鏈探針則可以解決這些問題。復性可以在正常的雜交條件下進行，因為沒有互補的單鏈和靶RNA競爭探針。但是當Berk和Sharp進行研究時，還沒有可靠的方式去除其互補部分的單鏈DNA。鏈分離凝膠電泳是那時惟一可行的方式，但它始終是一種技巧性很強、難于掌握的技術。只有70%的DNA片段可以得到分離，而且即使在相當成功的條件下，樣品中也不可避免的污染互補DNA單鏈。直到20世紀80年代后期，通過制造有高度特異活性的標記單鏈DNA或RNA探針才解決了這一問題。

S1核酸酶保護試驗中使用的探針通常是由雙鏈DNA兩條鏈分離得到的，已知極性且特異性高。或者更普遍地，從頭合成與雙鏈DNA模板的一條鏈互補的RNA或與單鏈模板互補的DNA。

鏈分離的探針通過同時或依次使用兩種Ⅱ型限制性內切核酸酶預處理，產生在5′端和3′端各有一段突出的合適大小的DNA片段(通常100~500個核苷酸)。因此該片段的一條鏈zui多可以比另一條鏈長8個核苷酸。在變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳已足夠分離這種差異的兩條鏈。在電泳前或電泳后，目的單鏈的5′端被去磷酸化并從[γ-32P]得到標記的磷酸基團，從而在體外被標記，T4噬菌體多核苷酸激酶催化這一反應。

從頭合成探針法用來體外產生末端標記或均勻標記的DNA探針。末端標記的探針通過將寡核苷酸引物的5′端磷酸化而得到。均勻標記的探針通過放射標記的核苷酸引入正在合成的DNA單鏈得到。在兩種情況下，通過一種可識別新合成的雙鏈DNA上特異位點的限制性酶酶切，分離新合成的DNA鏈和模板。接下來可以用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離放射性標記的探針和線性化的單鏈DNA。