一．實驗目的
通過本實驗的學習，了解和掌握植物轉基因技術的原理和方法，以及轉基因植物的篩
選和鑒定的基本過程。
二．實驗原理
植物轉基因技術(plant trasgenetic technology)是指把從動物、植物或微生物中分離到的目
的基因，通過各種方法轉移到植物基因組中，使之穩定遺傳并賦予植物新的性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產、等。
1．植物基因轉化的方法
目前已發展了許多用于植物基因轉化的方法，這些方法可分為3大類：一類是載體介導的轉化方法，即將目的基因插入到農桿菌的質粒或病毒的DNA 等載體分子上，隨著載體DNA的轉移而將目的基因導入到植物基因組中。農桿菌介導和病毒介導法就屬于這種方法。第二類為基因直接導入法，是指通過物理或化學的方法直接將外源目的基因導入植物的基因組中。物理方法包括基因槍轉化法、電激轉化法、超聲波法、顯微注射法和激光微束法等；化學方法有PEG 介導轉化方法和脂質體法等。第三類為種質系統法，這包括花粉管通道法、
生殖細胞浸染法、胚囊和子房注射法等。
(一) 載體介導的轉化方法
1 根癌農桿菌介導轉化法
根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌。它能在自然條件下感染大多數雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤(crown gall tumor)。根癌農桿菌細胞中含有Ti 質粒(tumor-inducing plasmid，瘤誘導質粒)。在Ti 質粒上有一段T-DNA(T-DNA region)，即轉移-DNA(transfer-DNA)，又稱為T區(T region)。根癌農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA 插入到植物基因組中。因此，根癌農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA 區，借助根癌農桿菌
的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。
（1） Ti 質粒的結構與功能
Ti 質粒是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙鏈共價閉合的環狀DNA分子。Ti 質粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。根據其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類，Ti 質粒可分為4 類：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農桿堿型(agropine)和農桿菌素堿型(agrocinopine)。
Ti 質粒可分為4 個功能區域：①T-DNA區(transferred-DNA region)：T-DNA是根癌農桿菌侵染植物細胞時從Ti 質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA；②Vir 區(virulence region)：Vir 區上的基因能激活T-DNA 轉移，使根癌農桿菌表現出毒性；③Con 區(regions encoding conjugations，接合轉移編碼區)：該區段上存在與細菌間接合轉移的有關基因，調控Ti 質粒在農桿菌之間的轉移；④Ori區(origin of replication，復制起始區)：Ori區上的基因調控Ti 質粒的自我復制。

T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因。其中tms和tmr 2 套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。tms基因組由iaaH和iaaM 2 個基因組成，控制由色氨酸產生生長素吲哚乙酸的生物合成途徑；tmr 基因組中的iptZ 負責由異戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反應；tmt 基因組的編碼產物可催化合成冠癭堿(Opines)。冠癭堿的代謝產物為氨基酸和糖類，是根癌農桿菌生長必需的物質，供根癌農桿菌作為營養使用。
此外，在T-DNA 的兩端還含有左右2 個邊界，左邊界(left border, LB)和左邊界(right border, RB)是長為25bp的末端重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。
（2）Ti 質粒的轉化機理
根癌農桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位會分泌出酚類物質乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質能誘導Ti 質粒上的vir基因以及根癌農桿菌染色體上的一個操縱子表達。vir 基因產物將Ti 質粒上的T-DNA 單鏈切下，而根癌農桿菌染色體上的操縱子表達產物則與單鏈T-DNA 結合形成復合物，轉化植物根部細胞。整個過程大致可分為以下幾個步驟：①根癌農桿菌對植物細胞的識別和附著；②根癌農桿菌對植物信號物質的感受；③根癌農桿菌Ti 質粒上的vir 基因以及染色體上操縱子的活化；④T-DNA 復合體的產生；⑤T-DNA復合體的轉運；⑥T-DNA整合到植物基因組中。
（3）野生型Ti 質粒的改造和中間載體的構建
Ti 質粒是植物基因工程的一種天然載體。但野生型Ti 質粒不能直接用作克隆外源基因的載體。這主要表現在：①野生型Ti 質粒分子過大，因而在基因工程中操作起來十分麻煩；②野生型Ti 質粒上分布著各種限制型核酸內切酶的多個酶切位點，不論用何種限制型核酸內切酶切割，都會切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很難找到可利用的單一的酶切位點；③T-DNA上的tms和tmr 基因產物將干擾受體植物內源激素的平衡，導致冠癭瘤的產生，阻礙轉基因植物細胞的分化和植株的再生；④冠癭堿的合成過程消耗大量的精氨酸和谷氨
酸，直接影響轉基因植物細胞的生長代謝；⑤野生型Ti 質粒沒有大腸桿菌(Escherichia coli)的復制起點和作為轉化載體的選擇標記基因。因此，必須對野生型的Ti 質粒進行改造后才能作為轉基因植物的載體。
對野生型Ti 質粒的改造，主要包括以下幾個方面：①刪除T-DNA上的tms、tmr和tmt
基因；②加入大腸桿菌復制起點和選擇標記基因，構建根癌農桿根瘤菌-大腸桿菌穿梭質粒，便于重組分子的克隆與擴增；③引入植物細胞的篩選標記基因，如細菌來源的新霉素磷酸轉移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于轉基因植物細胞的篩選；④引入植物基因的啟動子和polyA化信號序列；⑤插入人工多克隆位點，以利于外源基因的克隆。⑥除去Ti 質粒上的其它非必需序列，zui大限度地縮短載體的長度。由于大腸桿菌具有能與根癌農桿菌接合轉移的特征。因此，為了使Ti 質粒成為有效的外源基因導入載體，科學家們將T-DNA片段克隆進大腸桿菌的質粒，并插入目的基因，而后通過接合轉移將目的基因引入到根癌農桿菌的Ti 質粒。帶有重組T-DNA的大腸桿菌衍生載體稱為中間載體(intermediate vector)，而接受中間載體的Ti 質粒則稱為受體Ti 質粒(acceptor Ti plasmid)。構建中間載體是解決Ti 質粒不能直接導入目的基因的有效方法之一。